• Publié par : Denis CHRETIEN
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30 mars 2017

Mécanismes de l'hydrolyse du GTP par la tubuline au cours de son assemblage en microtubules

Contexte socioéconomique et scientifique

Les microtubules sont des fibres constitutives du cytosquelette formées par la polymérisation d’hétérodimères de tubuline (α,β). Ils sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que la division, la motilité ou encore la différentiation. Leur importance en fait des cibles de choix pour le développement de nouvelles molécules à visée thérapeutique (ex. chimiothérapie). La tubuline lie deux molécules de GTP, dont l'une est hydrolysée en GDP lors de l'assemblage. Un délais entre la polymérisation et l'hydrolyse du GTP permettrait la formation d'une "coiffe-GTP" (GTP-cap) protégeant le microtubule de la dépolymérisation. Néanmoins, cette structure n'a jamais pu être observée directement. La découverte récente d'une classe de protéines (EBs : End-Binding Proteins) qui se lierait spécifiquement au GTP-cap ouvre aujourd'hui la possibilité d'analyser sa structure et sa dynamique en fonction des conditions physico-chimiques d'assemblage.

Les hypothèses et questions posées

Des résultats récents obtenus au laboratoire suggèrent que le GTP-cap incorpore une région composée de feuillet courbes de tubuline et une partie de la paroi complète du microtubule (Guesdon et al., Nat Cell Biol., 2016). Selon ces observations, la tubuline subirait un changement de conformation imposé par le redressement graduel des feuillets courbes en tube, induisant l'hydrolyse du GTP en un intermédiaire GDP-Pi, suivi du relarguage progressif du phosphate inorganique. Pour affiner ce modèle, il sera nécessaire de relier précisément les changements de conformation de la tubuline en relation avec son cycle d'hydrolyse du GTP.

Les grandes étapes de la thèse et démarche

L'ensemble de la thèse fera largement appel aux reconstructions tridimensionnelles de microtubules par cryo-tomographie électronique. Dans un premier temps, l'organisation du GTP-cap sera analysée à l'aide de la protéine EB1 conjuguée à des nanoparticules d'or. Dans un second temps, la structure des extrémités de microtubules assemblés en présence d'analogues du GTP sera analysée par sous-moyennage de tomogrammes, afin de relier précisément la conformation de la tubuline dans les feuillets en croissance avec son état nucléotidique. En parallèle, des expérience de dépolymérisation de microtubules assemblés en présence de ces analogues seront effectuées afin de révéler la conformation intrinsèque de la tubuline dans les oligomères de dépolymérisation. l'ensemble de ces résultats devra permettre de construire un modèle cohérant décrivant les relations existantes entre les changements de conformation de la tubuline et l'hydrolyse du GTP lors de son assemblage en microtubules. Ce projet sera effectué dans le cadre d'un financement obtenu auprès de l'ANR pour la période 2017-2020.

Approches méthodologiques et techniques envisagées

Les approches méthodologiques envisagées au cours de cette thèse incluent la purification de la tubuline et des protéines recombinantes associées aux microtubules (MAPs), la préparation des échantillons pour la cryo-microscopie électronique, l'acquisition de séries inclinées (cryo-tomographie électronique), leur reconstruction en trois-dimensions et le sous-moyennage de cryo-tomogrammes. Le suivi de la dynamique d'assemblage des microtubules sera effectué par microscopie à fluorescence (spinning disk microscopy).

Compétences scientifiques et techniques requises par le candidat

Connaissances en biochimie, biologie moléculaire, biologie structurale et/ou bio-informatique (analyse d'images). Bonnes connaissances en anglais requises.

Pour une candidature ou des informations

Veuillez envoyer aux Drs Denis Chrétien et Laurence Duchesne les informations ci-dessous (de préférence par email et en PDF):

  • Un Curriculum Vitae (CV)
  • Une lettre exposant vos motivations et compétences pour mener ce projet
  • Le nom de deux personnes pouvant vous fournir des références
  • Date de diffusion : 30/03/2017
  • Début de la thèse : Octobre 2017
  • Affectation : Institut de Génétique et Développement de Rennes - Equipe Tubulin and interacting Proteins
  • Lieu : Campus scientifique de Beaulieu, Rennes
  • Mots clés : Cytosquelette / Microtubules / Relations Structure-Fonction / Instabilité Dynamique
  • Techniques : Biochimie / Biologie moléculaire / Cryo-microscopie électronique / Analyse d'image / Reconstructions 3D
  • Financement : Bourse fléchée (3 ans)
  • Cloture des candidatures : 7 juin 2017
  • Modalités du concours : site de l'école doctorale Vie-Agro-Santé et site des thèses de l'Université européènne de Bretagne